Son activité de recherche est centrée sur l'analyse évolutive des génomes et des réseaux biologiques. Dans ce cadre, Olivier Lespinet participe au développement de plusieurs projets dont les plus significatifs sont l'évolution de la synténie chez les procaryotes, la découverte et l'identification des activités enzymatiques orphelines, l'annotation et l'analyse du génome du champignon filamenteux Podospora anserina, l'étude de la diversité, de la dynamique et de l'évolution des réseaux biologiques et l’étude des réseaux biologiques (réseaux de régulation génétique, réseaux d'interactions protéiques, réseaux métaboliques) est un bon moyen de comprendre comment évolue et fonctionne le vivant. En dehors des approches purement expérimentales visant par exemple à dresser la liste des protéines interagissant les unes avec les autres dans une condition physiologique donnée pour un organisme particulier, des approches in silico se basant sur ces données expérimentales couplées aux approches de génomique comparées permettent également aujourd’hui d’étudier les réseaux biologiques.